研究意义】铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)别名铁皮兰、黑节草，属兰科石斛属多年生附生草本植物，被誉为药材之上品。祖传医学和现代医学认为，铁皮石斛具有健脾养胃、滋阴补肾、润肺生津等功效;用于治疗慢性萎缩性胃炎、高血压、糖尿病、抗肿瘤、抗衰老等;长...
下一个：叶下珠组培快繁体系研究
【研究意义】铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)别名铁皮兰、黑节草，属兰科石斛属多年生附生草本植物，被誉为药材之上品。祖传医学和现代医学认为，铁皮石斛具有健脾养胃、滋阴补肾、润肺生津等功效;用于治疗慢性萎缩性胃炎、高血压、糖尿病、抗肿瘤、抗衰老等;长期服用具美容、抗衰老和延年益寿之功效(蔡光先等，2011)。由于铁皮石斛的重要药用价值和保健作用，近几十年来人们对野生铁皮石斛的需求量急剧增加，导致人们掠夺式采集，其资源日趋减少，已被列入植物保护红皮书(傅立国和金鉴明，1992)。铁皮石斛人工快繁不仅可以摆脱人们单纯依靠采集野生铁皮石斛的状态，还对森林生态条件和生物多样性保护及铁皮石斛资源持续开发利用均具有重要的现实意义。【前人研究进展】自20世纪70年代以来，国内外学者开始对铁皮石斛进行组织培养和快速繁殖研究。王碧琴和盖安俊(2006)研究结果发现，铁皮石斛的外植体在MS+6-BA 0.5～2.0 mg/L+ NAA 0.25～0.4 mg/L或2，4-D 0.25 mg/L培养基中能诱导分化丛生芽3～5倍;原球茎分化丛生芽10～15倍;壮苗后在1/2MS+NAA 0.2～0.5 mg/L中诱导生根，生根率达90%以上。Huang等(2011)探讨铁皮石斛种子萌发、芽增殖和生根的适宜培养基，认为经马铃薯泥、香蕉泥培养的铁皮石斛组培苗，生长健壮，能为生产提供大量的种苗。此外，铁皮石斛不定芽的生根培养基主要有N6+NAA 2.5 mg/L+10%土豆汁(袁正仿等，2002)、1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC(朱艳和秦民坚，2003)、MS+NAA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L(单芹丽等，2010)等。【本研究切入点】目前，铁皮石斛试管苗快繁的培养基配方已很成熟，影响组培快繁技术实现产业化的瓶颈是试管苗的大田移栽(温明霞等，2007)，培养健壮，尤其是生根多、根长的试管苗是提高移栽成活率的根本措施。【拟解决的关键问题】采用正交试验考察光照强度、pH和琼脂用量对铁皮石斛丛生苗生根效果的影响，克服单因素试验研究的不足，优化其生根培养条件，为产业化生产中优良种苗的供应提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
铁皮石斛于2010年6月采自云南省昆明地区，部分植株经诱导培养出原球茎保存于三亚市南繁科学技术研究院组织培养研究室。增殖过程中部分原球茎分化出丛生芽，挑选1 cm以上的丛生小苗进行生根试验。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基选择 选择1/2MS+10%香蕉汁+NAA(1.0～3.0 mg/L)+6-BA(0～0.5 mg/L)+0.5%AC+7.5 g/L琼脂作为铁皮石斛的壮苗生根培养基，培养条件：培养室温度25℃，湿度50%～60%，光照强度1500 lx，每天光照12 h，pH 5.5。根据激素配比设6个处理，每处理接种15瓶，每瓶6株，重复3次。60 d后统计小苗鲜重和生根苗数，计算生根率。
生根率(%)=生根苗数/总苗数×100
1.2.2 培养条件筛选 在选择培养基的基础上，设计L9(34)正交试验，对光照强度、pH和琼脂用量3因素选取3水平形成9个处理对铁皮石斛生根条件进行研究(表1)，每处理接种15瓶，每瓶6株，重复3次。培养温度25℃，培养室湿度50%～60%，每天光照12 h。
表1 铁皮石斛生根的试验因素及水平
Tab.1 Experimental factors and levels ofDendrobium officinalerooting in vitro
1.2.3 统计分析 定期观察记录试管苗的长势情况，使用SPSS 17.0软件和Excel软件进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同激素处理对试管苗壮苗生根的影响
从表2可知，接种60 d后，随着MS培养基中NAA浓度的升高，试管苗的鲜重和生根率呈逐渐降低的趋势，不同处理间试管苗的鲜重和生根率差异明显;其中，MS培养基中添加NAA 1.0 mg/L(处理1)和NAA 2.0 mg/L(处理3)的试管苗长势好，表现出生长迅速、叶片肥厚、茎粗壮、根系发达等优势，试管苗的平均鲜重和生根率高，与其他处理间差异显著。在添加NAA 1.0～3.0 mg/L和6-BA 0.5 mg/L组合的MS培养基中，随着NAA浓度的升高，试管苗的鲜重和生根率不断显著提高，但均低于仅添加NAA的处理。
表2 不同激素处理对试管苗的影响
Tab.2 The impact of different hormone treatments of plantlets
同列不同小写字母表示在5%水平上的差异显著性
Different lowercase letters in the same column represent the significant difference at 5%level
2.2 不同培养条件对试管苗生根的影响
试管苗在接种13 d后，叶片变绿，开始长出白色纤细根须。接种30 d后，叶片浓绿，茎伸长2～3倍，节间明显，根增长变粗，附有根毛。接种60 d后，大部分植株生长健壮，有的茎叶甚至顶到培养瓶瓶塞;不同处理的生根数为1～8条，根长0.5～5.0 cm，以处理5、7、9的根多、长，处理1、2、3的根生长缓慢(表3)。此外，部分铁皮石斛试管丛生苗在接种生根培养基时已出现1～2条短根，这些丛生苗生长速度较快。
表3 铁皮石斛正交实验结果
Tab.3 Orthogonal test results ofDendrobium officinale
T代表生根数均值，X代表根长均值，R代表极差
“T”represents average rooting number，“X”represents average root length，“R”represents range
2.3 极差分析与方差分析
从表3可知，影响生根数的3因素主次顺序为A>C>B，优水平组合为A3B2C3;影响根长的3因素主次顺序A>C>B，优水平组合为A3B1C3。可见，A因素(光照强度)对铁皮石斛试管苗生根的影响大，其次是C因素(琼脂用量)的影响，B因素(pH值)的影响弱。试管苗生根越多越易存活，从平均生根数上考虑，生根培养基的3因素优水平组合为A3B2C3。
表3中3因素的极差分析结果都大于误差项(空列)，说明它们对试管苗根的生长都有不同程度的影响，需采用方差分析进一步验证。对试管苗平均生根数进行方差分析，从表4可以看出，A因素(光照强度)和C因素(琼脂用量)对试管苗生根数的影响较大，二者分别达极显著水平和显著水平，B因素(pH值)对铁皮石斛试管苗生根数的影响较小。对试管苗平均根长进行方差分析，从表5可知，A因素(光照强度)和C因素(琼脂用量)对试管苗根长的影响较大，二者均达显著水平，B因素(pH值)对铁皮石斛试管苗根长的影响较小。综上所述，极差分析结果和方差分析结果高度一致。
3 讨论
近年来，许多学者对铁皮石斛人工快繁进行了大量研究，并在培养基选择及其成分配比方面取得很大进展。本研究选用铁皮石斛生根主流培养基，通过优化激素配比，并在此基础上研究光照强度、pH和琼脂用量3因素对生根效果的影响，从而确定试管苗的佳生根条件。在含10%香蕉汁的MS培养基中添加低浓度NAA时，有利于铁皮石斛试管苗的伸长生长及根系发生，而添加6-BA和高浓度的NAA具有一定的抑制作用。在生产上，向培养基中添加1.0～2.0 mg/L NAA用于生根培养为适宜。在选择适宜的生根培养基后，光照强度和琼脂用量对铁皮石斛试管苗生根的数量和长度有显著影响，而pH值的影响不显著。适宜的酸性条件加快了根的形成和植株对营养的吸收，达到生根壮苗的目的，本研究设定的酸性范围(5.0～6.0)对根生长没有显著差异，但酸度太低或太高都不利于植株生长(陈青青等，2010)，而且10%香蕉泥添加物对维持培养基pH起一定缓冲作用。在研究过程中，发现在较强光照培养条件下的试管苗根多且长，有利于试管苗移栽成活率的提高，说明光照强度大小是培养铁皮石斛试管苗的关键因素之一。琼脂的用量影响固体培养基的软硬程度，本研究结果表明，较硬的培养基促进了根的发生和生长，这可能与铁皮石斛喜欢附生的自然特性有关。
表4 平均生根数方差分析结果
Tab.4 The variance analysis of average rooting number
表5 平均根长方差分析结果
Tab.5 The variance analysis of average root length
4 结论
铁皮石斛试管苗适宜的生根培养基为1/2MS+ 10%香蕉泥+NAA 1.0 mg/L+2%蔗糖+0.05%AC，试管苗生长健壮、根系发达;适宜的生根条件为光照强度2000 lx、琼脂用量8 g/L、pH 5.5。
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