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木本植物组织培养中的关键因素

木本植物组织培养中的关键因素

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在对植物进行组织培养研究时,首先需考虑培养基选择的问题,而基本培养基的选择是在研究中优先被考虑。现今,依照基本培养基的成分与元素的浓度,大致分为4个类型:富集元素平衡培养基(包括MS、LS、BL、ER等),高硝酸钾含量培养基(包括B5、N6、SH等),中等无机盐含量的培养基(包括H、Nitsch、Miller等)和低无机盐培养基(包括White、WS、HE等)。在绝大多数的植物组织培养中,通常选择MS培养基作为基本培养基,但也需要...

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详细介绍

  一、基本培养基

  在对植物进行组织培养研究时,首先需考虑培养基选择的问题,而基本培养基的选择是在研究中优先被考虑。现今,依照基本培养基的成分与元素的浓度,大致分为4个类型:富集元素平衡培养基(包括 MS、LS、BL、ER等), 高硝酸钾含量培养基(包括 B5、N6、SH等),中等无机盐含量的培养基(包括 H、Nitsch、Miller等)和低无机盐培养基(包括White、WS、HE等) 。在绝大多数的植物组织培养中,通常选择MS培养基作为基本培养基,但也需要参照目标植物的近缘物种的相关研究成果进行选择基本培养基。不过,在一般情况下,植物能够适应多种基本培养基,但不同的诱导培养目的,选择最佳的基本培养基不同。

  在对麻疯树的组织培养研究中,以幼胚为外植体,去除胚乳,接种MS、LM、WPM、N6 4种未添加任何植物激素的培养基上进行培养,发现N6早生出胚根,而MS与WPM能够大量诱导出愈伤组织,并且WPM培养基上的分化不定芽数量最多,在不定芽生根中,以LM与WPM培养基的生根诱导率最高,不过WPM培养基上的主根较少,侧根系发达,因此WPM培养基是最佳培养基。虽然基本培养基在植物组织培养中起到支撑作用,但各种培养基都包含了植物生长所需的基本元素,只是其浓度比例不一,并且在实际培养中仍需添加激素、抗氧化剂或一些物质进行补充,使得培养效果达到最佳。


  二、植物激素

  在1905年德国植物学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性的概念时,植物组织培养技术就已经开始发展,不过其技术发展历程十分艰辛与缓慢,很大的原因是当时尚未发现对植物细胞生长分化起着促进作用,但其浓度很低的物质,后来这类物质被称为植物激素。目前,天然植物激素因其主要的调控作用,被分为5类:生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯和脱落酸。由于天然植物激素在植物体内含量极微,因此想从天然来源提取激素十分困难且不经济。在了解天然植物激素化学结构后,现如今已经可以大量人工合成植物激素,并对原有结构进行改变,制成活性更强的植物激素类似物,如常用的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)与KT(激动素)等物质。自植物激素运用以来,植物组织培养技术不断实现对不同品种植物的离体再生,获得完整植株。

  1 生长素

  生长素是最早被发现的一类植物内源激素,参与了植物根和茎的发育、器官的衰老与维管束组织的形成等方面的植物生长分化过程。在植物组织培养研究中,常用的生长素主要包括IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NAA、2,4-D,其中以2,4-D的活性最强,浓度过高,易引起遗传变异。并且过高的生长素浓度会对木本植物诱导芽增殖起到抑制作用。

  在对不同生长素影响喜树组培苗生根的研究中发现,IBA比NAA对诱导生根效果要好,但两者浓度过高都会对生根造成抑制效果,最佳的浓度为IBA 0.5 mg/L。而在对红松的组织培养研究中,也获得了相似的结果,在生长素类激素含量较高时发生不定根。在对枣树愈伤组织形成的不定芽进行不定根诱导的研究中发现,IBA效果最好 ,其次是 IAA,NAA生根率低,并且仍会有大量愈伤组织生成,而2,4-D主要以愈伤组织诱导为主。

  2 细胞分裂素

  细胞分裂素是在组织培养中另一种重要的植物内源激素,通常与生长素一起使用,两者相辅相成,能够达到更好的培养效果。细胞分裂素大致可分成两类,一类是嘌呤型细胞分裂素(CTK),另一类是苯基脲型细胞分裂素(PUD)。植物组织培养中常用的第一类嘌呤型细胞分裂素,包括BA(苄基腺嘌呤,又称 6-BA,BAP),KT(激动素,KIT,KIN),2IP(2-异戊烯基腺嘌呤),ZEA(玉米素,即异戊二烯腺嘌呤,又称ZT)。苯基脲型细胞分裂素是新型的细胞分裂素,其中TDZ(噻苯隆)是人工合成的一种植物激素,因具有高度的细胞分裂素活性,也常被使用。在对红松和枣树的组织培养研究中,发现细胞分裂素BA对诱导不定芽的效果较好,不过BA会抑制不定根的产生。在防止酸樱桃组培苗玻璃化的研究中,发现BA会提高玻璃化率,而KT对玻璃化无影响。在探讨TDZ对于木本植物组织培养中的影响认为,TDZ能够促进许多再生困难的木本植物品种完成微繁殖过程,在浓度低于1 μmol/L时,能够使腋芽增殖,但可能抑制芽的伸长;在浓度高于1 μmol/L时,能够刺激愈伤组织的形成、诱导丛生芽与体细胞胚发生。


  3 赤霉素

  赤霉素至今已发现100多种,总称为赤霉素类(GAs)。其中只有少数赤霉素对植物的生长发育具有生物活性,在木本组织培养的研究中应用较多的是GA3。GA3的作用类似于生长素,但与其不同的是,GA3对完整植株的作用要强于对离体器官或组织的作用。GA3可刺激器官的生长,却抑制器官的发生,如GA3对不定根的产生具有抑制作用,但在根原基形成以后,则不对不定根的发生造成影响。

  在对龙眼和荔枝的组织培养研究中发现,GA3对两者的愈伤组织诱导具有抑制作用,应该省去不用。在对白木香组织培养技术及植株再生的研究中发现,GA3仅对种子萌发具有促进作用,其余诱导器官发生的部分都不宜使用。而在对于美国月桂樱组织培养研究中发现,GA3对芽的伸长没有效果。据相关报道,赤霉素能促进植物开花,但对于植物离体再生作用较小,尚没有广泛运用。

  4 乙烯

  乙烯是一种气态的植物激素,广泛存在于植物成熟的果实果皮中,对催化果实成熟有促进作用。而乙烯对于植物组织培养作用方面的研究尚少。 都对乙烯在愈伤组织诱导、体细胞胚发生、不定芽与不定根的诱导等相关研究进行了概述,表明了乙烯在不同植物品种中具有起到的作用不一,而在木本组织培养中,乙烯的作用很少涉及。谢耀坚在对欧洲云杉胚性愈伤组织培养中乙烯的释放及其作用的研究中,发现乙烯释放量的变化对胚性愈伤组织的诱导率无明显促进或抑制作用。乙烯在木本植物组织培养方面的作用仍需进一步研究。

  5 脱落酸

  脱落酸作为五大类激素之一,对植物细胞分裂扩增起着重要调控作用,而且经常在组织培养方面,通过提高愈伤组织的干燥耐受性和防止提早发芽,从而促进体细胞胚的发生与提高体细胞胚的质量。脱落酸不只调节植物细胞的生长发育,还在植物细胞受到胁迫时发挥作用。因此,脱落酸以其在植物生长发育中所起的独特作用,近年来不断受到科学家的青睐,研究深度与广度逐步增加。

  进行了脱落酸对棕榈树体细胞胚发生的影响研究,发现添加0.1 mg/L脱落酸时,促进的体细胞胚发生量最大,浓度过高则会减少体细胞胚的发生量。同样以棕榈树为研究对象,发现运用悬浮培养方式,与添加50~100μmol/L的脱落酸浓度对同步化诱导体细胞胚具有促进作用。在利用未成熟的椰子种子为外植体,进行愈伤组织诱导后,以添加7.5 μmol/L的脱落酸浓度,体细胞胚发生量最大,但无法进一步萌发出芽,而5~5 μmol/L的ABA浓度,可以成功生出芽。

  三、碳源

  在对植物细胞进行组织培养时,除了需要添加植物激素,与基本培养基所提供的基本营养元素外,生长发育主要所需的能量物质是由碳源物质所提供的。碳源一般是糖类物质,常用的碳源物质有蔗糖、葡萄糖、果糖与半乳糖等。其中蔗糖与果糖,在植物组织培养中最为广泛运用。碳源不只是为植物细胞提供能量物质,还能为植物细胞提供渗透压,提供细胞吸取养分的动力,而渗透压与碳源的种类与浓度密切相关。

  蔗糖是植物组织培养中,最常用的碳源物质,属于非还原性二糖。蔗糖在供能外,还能促进愈伤组织的再分化。由于植物细胞对蔗糖的吸收速率较慢,因此蔗糖能够长期保持较稳定的渗透压,为植物细胞生长发育提供稳定的环境。而且蔗糖一般不能被微生物直接利用,对微生物的污染有一定程度的减轻效果。

  利用不同碳源对桑树茎尖进行培养时,发现果糖是桑树诱导芽尖与继代培养效果最佳的碳源,而葡萄糖可在继代培养中替代果糖,达到更好的培养效果。利用不同碳源对猕猴桃的组织培养研究中发现,蔗糖和葡萄糖对芽的分化效应无明显差异,不过低浓度的碳源不能很好地进行芽分化和生长,而高浓度的碳源虽能较好地诱导芽分化,但抑制了后期芽的生长。在植物组织培养中,一般多用蔗糖作为培养基碳源,对于个别植物的组织培养则以葡萄糖与果糖这些单糖作为碳源更佳。因此,对植物组织培养中碳源种类与浓度的选择也是必不可少的关键环节。


  四、pH值

  pH值在植物组织培养研究中,通常代表着培养基中的酸碱度。大多数植物在离体培养中,pH值的要求5.0~6.2。适宜的pH值,是植物组织离体再生过程中能够正常吸取生长养分的重要影响因素。并且pH值能够影响培养基的凝固程度,当pH较低(≤4.0)时,加入一定量的凝固剂,培养基都难于凝固。而培养基的凝固程度对培养物的支撑作用,对其保证正常生长发育具有重要意义。

  在钙离子与pH值对柚木组培苗生长和矿质养分吸收影响的研究中发现,pH值对苗高生长及愈伤组织生物量积累有显著影响,适宜pH值为6.0,只有稳定在最适pH值上,增加钙离子浓度,才会增加柚木组培苗的营养元素吸收。对3个越橘品种组培苗在pH值5~9条件下培养发现,不同越橘品种在相同pH值条件下生长状况不一致。因此,表明pH值是影响植物组织培养的关键因素之一,而且不同植物品种的最适pH值都有所不同。