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中草药熏蒸用于组培室空气消毒效果研究

文章作者:组培室 发布时间:2019-09-21 08:38:10 浏览次数:0

  金线莲又名金丝草,为兰科开唇兰属多年生草本植物,是我国传统名贵中药,具有清热凉血、除湿解毒等功效,用于治疗糖尿病、肾炎、膀胱炎等症,在民间享有“药王” 的美称。金线莲长期以来依靠采挖收集野生资源,而野生金线莲繁殖率极低,致使资源蕴藏量迅速下降,部分传统产区已无药可采。金线莲种苗是其栽培的关键环节,种苗的优劣直接关系到金线莲的生长发育、产量和品质。由于金线莲种子不具胚乳,只有在真菌共生下,才能促使其种子萌发生长,所以生产上主要采用茎段进行组织培养。但在组培生产过程中,由细菌、真菌等微生物引起的污染问题一直是当前制约金线莲种苗繁育的主要障碍。

  金线莲组培苗的污染与组培室培养环境的洁净度直接相关,而组培室往往是密闭的,空间洁净度差,空气流通少、湿度大,易导致各种细菌、真菌等微生物滋生。针对组培室的空气灭菌,传统的方法是使用甲醛高锰酸钾熏蒸、紫外灯照射、过氧乙酸熏蒸、75%乙醇喷洒及空气灭菌器等。甲醛高锰酸钾熏蒸、紫外线照射对组培材料和人体有害,安全性较差;过氧乙酸熏蒸或75%乙醇喷洒易引起组培室湿度升高;空气灭菌器,成本投入过大,不适用于工厂化生产。本文针对金线莲组培育苗污染率高的问题,分析艾叶和苍术熏蒸对组培室空气细菌和霉菌的灭菌效果,获取艾叶和苍术的优化用量,依此比较艾叶和苍术联合熏蒸与甲醛高锰酸钾熏蒸、过氧乙酸熏蒸的灭菌效果,旨在筛选降低金线莲组培污染率、降低生产成本、提高效率的组培室灭菌方法。

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  1 材料与方法

  1.1 材料

  艾叶和苍术购于杭州华东中药饮片有限公司;乙醇、甲醛、高锰酸钾、过氧乙酸为分析纯试剂;采用金线莲组培的继代培养基进行菌类培养。

  1.2 方法

  1.2.1 处理设计

  设置3个艾叶用量梯度1.0,2.0,4.0 g.m-3和3个苍术用量梯度1.0,1.5,2.0 g.m-3,分别测定组培室空气的含菌数,获取艾叶和苍术的优化用量。比较艾叶和苍术联合熏蒸法与甲醛高锰酸钾熏蒸法、过氧乙酸熏蒸法的灭菌效果。

  1.2.2 熏蒸灭菌方法

  艾叶熏蒸方法。艾叶经干燥后直接点燃熏蒸。

  苍术熏蒸方法。用95%乙醇浸泡24 h,用时以乙醇为助然剂点燃熏蒸。

  甲醛高锰酸钾熏蒸方法。甲醛2.0 m L.m-3+高锰酸钾1.0 g.m-3熏蒸。注意将甲醛溶液倒入盛装高锰酸钾的容器后,人员立即撤离。

  过氧乙酸熏蒸方法。20%过氧乙酸3.0 m L. m-3液置于耐热容器中,电炉加热熏蒸。

  1.2.3 菌类检测与统计

  采用自然沉降法测定菌类数量。打开培养皿盖暴露15 min,分别在熏蒸前、后 (熏蒸后3 d)各采样1次,在室温下培养2 d,然后按霉菌、细菌进行菌落数分类统计。分别在组培室的四周(距墙50 cm左右)和中间两处共6个点进行采样。根据奥氏公式计算组培室空气的含菌数(m-3),再计算得出灭菌率,分析各方法的灭菌效果。

  空气菌落总数/m-3=50 000 N/A×T。

  式中:A为培养皿面积 (cm2),T为培养皿暴露时间 (min),N为培养皿平均菌落数。

  2 结果与分析

  2.1 艾叶熏蒸的灭菌效果

  在不同艾叶用量梯度下,金线莲组培室空气灭菌效果存在差异 (表1)。

  表1 艾叶不同用量熏蒸处理的灭菌效果

  


  由表1可知,艾叶用量为4.0 g.m-3时,灭菌率高,为60.8%~68.4%;用量为1.0 g.m-3时,灭菌率低,为43.2%~63.9%。结果显示,艾叶对霉菌的灭杀效果优于细菌。随着艾叶用量的增加,两者间的差异降低。艾叶用量为1.0 g.m-3时,对霉菌的灭杀率与对细菌的灭杀率间的差异大,为20.7百分点。因此艾叶用量2.0 g.m-3进行熏蒸是工厂化生产较优且经济的选择。

  2.2 苍术熏蒸的灭菌效果

  在不同苍术用量梯度下,金线莲组培室空气灭菌效果存在差异 (表2)。

  表2 苍术不同用量熏蒸处理的灭菌效果

  


  由表2可知,苍术用量在1.0,1.5和2.0 g. m-3时,金线莲组培室空气灭菌效果存在差异。苍术对细菌的灭杀效果优于霉菌。随着苍术用量的增加,两者间差异降低。苍术用量为1.0 g.m-3时,对细菌的灭杀率与对霉菌的灭杀率间的差异大。用量为1.5 g.m-3时,灭菌率高。因此采用苍术用量1.5 g.m-3进行熏蒸是较优的选择。

  2.3 不同熏蒸方法灭菌效果比较

  由表3可知,1.0 g.m-3高锰酸钾和2.0 mL. m-3甲醛熏蒸法总灭菌率为71.5%,灭菌后含菌量<90 m-3,2.0 g.m-3艾叶+1.5 g.m-3苍术联合熏蒸的总灭菌率为65.4%,灭菌后含菌量<90 m-3,灭菌效果均达到组培对空气质量的要求;3.0 m L. m-3过氧乙酸熏蒸总灭菌率为67.0%,灭菌后含菌量为103 m-3。前者灭菌效果好,后两者灭菌效果差异不大,但甲醛高锰酸钾与过氧乙酸对人体伤害极大,要慎用;而苍术与艾叶联合熏蒸法,对人体几乎无害,且2种药材来源广泛,价格便宜,是一种理想的空气灭菌替代品。

  表3 不同熏蒸处理的灭菌效果

  


  2.4 艾叶和苍术联合熏蒸法在金线莲组培苗工厂化生产中的应用效果

  在金线莲组培苗工厂化生产中,连续3年应用艾叶与苍术联合熏蒸法对组培室进行灭菌,取得较明显的效果。

  由表4可知,与2010年相比,2012年金线莲组培苗细菌污染下降率为1.5百分点,霉菌污染下降率为1.6百分点。艾叶与苍术联合熏蒸法对金线莲组培生产空气灭菌效果较佳,适用于金线莲组培苗工厂化生产。

  表4 艾叶与苍术联合熏蒸后的金线莲组培污染率

  


  3 小结与讨论

  艾叶、苍术是常用中药材,其资源丰富,价格低廉,用于熏蒸灭菌时,操作简单易行且持续时间长久,已在医院的手术室、母婴产房、输液室以及发热门诊等灭菌中得以应用,但在组培室空气灭菌中应用较少报道。艾叶、苍术熏蒸能有效地灭杀或抑制细菌和真菌,本试验结果表明艾叶用量为2.0 g.m-3时的灭菌率为59.4%~69.0%,苍术用量为1.5 g.m-3时的灭菌率为51.4%~59.3%;艾叶对霉菌的灭杀效果比对细菌的好,而苍术对细菌的灭杀效果则优于对霉菌的效果。艾叶用量2.0 g.m-3和苍术用量1.5 g.m-3联合熏蒸法灭菌率达到65.4%;甲醛高锰酸钾熏蒸法灭菌率为71.5%;过氧乙酸熏蒸法灭菌率为67.0%。连续3年采用艾叶和苍术联合熏蒸,金线莲组培苗的污染率均降低。

  目前金线莲组培室空气灭菌,常采用甲醛高锰酸钾、过氧乙酸熏蒸。甲醛能引起慢性中毒,出现黏膜充血、皮肤刺激、过敏性皮炎等症,高锰酸钾与过氧乙酸都具有较强的腐蚀性,对皮肤和呼吸道有很大的刺激性,损伤呼吸道黏膜。苍术与艾叶联合熏蒸具有较强的杀菌作用,且效果持续时间长,对人体几乎无伤害,克服了传统灭菌方法的缺点,具有安全、高效、无毒害副作用的特点,是金线莲组培生产中一种理想的空气灭菌替代品。

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