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叶下珠组培方法研究

文章作者:组培室建设 发布时间:2019-09-29 09:03:04 浏览次数:0

叶下珠Phyllanthus urinaria为大戟科Euphorbiaceae叶下珠属植物,异名阴阳草、假油柑、真珠草、夜合珍珠等。叶下珠为一年生草本,生命期约6个月,高10~55 cm,是我国南方传统中草药。全草入药,有清热解毒、平肝明目、收敛利水、消肿消积等功效,民间用于治疗肝肿大、痢疾、湿疹、黄疸型肝炎、肠炎腹泻、外伤出血、小儿疳积、脚癣等疾病。现代药理研究证明,叶下珠具有明显的抗乙型肝炎病毒HBV和保肝降酶的作用,兼有抗肿瘤、抗艾滋病毒逆转录酶HIV-IRT活性,因此其市场需求不断增长。但叶下珠生命期短,仅局限在每年的夏季采收,通过采收野生资源的方式难以满足其日益增长的需求。组织培养方式使一年四季均有可采收的叶下珠资源,是解决这一问题的有效方法。目前对叶下珠的研究多集中在药理方面,而组培快繁方面的研究较少。

组培

本研究通过组织培养,对叶下珠进行芽的诱导、增殖、生根和炼苗移栽等,建立了一套完整的叶下珠组培快繁体系,为叶下珠大规模繁殖提供技术参考。

叶下珠组培方法

1、培养条件

基本培养基为 MS,琼脂 7.5 g·L-1,蔗糖为 30 g·L-1,pH 5.8~6.0。培养温度(25 ± 1) ℃,光照时间12 h·d -1,光照强度1000~1500 lx。

2、外植体接种

选取长势均匀的叶下珠植株,用剪刀剪取位于植株中部的茎段,去除叶片与假叶柄。加1~2滴洗洁精将茎段表面洗刷干净,流水冲洗5~6 h。于超净工作台上用75%酒精浸泡30 s,然后用0.1%升汞消毒13 min,无菌水冲洗5~6次,并用无菌滤纸擦干,置于接种盘上。用手术刀将外植体切成1.5~2 cm带节茎段,生物学顶端朝上接种于培养基上。

3、生长调节剂配比试验

将消毒外植体接种到按单因素多水平设计的不同生长调节剂配比的、添加0.5 g·L-1活性炭的MS培养基中,共计7组,分别为:IBA为0.2 mg·L-1,6-BA分别为1.0、1.5、2.0、3.0 mg·L-1;6-BA 为 1.5 mg·L-1,IBA 分别为 0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1 。每组 15 瓶,每瓶接 1个外植体,每3 d观察1次,15 d统计诱导情况。

4、诱导培养基 得出芽诱导最佳生长调节剂配方后,对比添加0.5 g·L-1活性炭的MS和1/2MS培养基的诱导效果,共2组,每组24瓶,每瓶接1个外植体,每4 d观察1次,20 d后统计诱导情况。

5、不同浓度6-BA对叶下珠芽的处理

将茎段诱导出的芽在超净工作台上切成1.5~2 cm带芽茎段,接种至添加不同浓度6-BA的培养基中,共计3组,每处理5瓶,每瓶2个,即每处理10个外植体,每5 d观察1次,25 d后统计芽增殖情况。

6、不同浓度NAA与IBA对丛生芽的处理

将增殖扩繁的丛生芽在超净工作台上分成单个芽,接种至添加蔗糖20 g·L-1的不同培养基中,共计6组,每处理5瓶,每瓶10个芽,即每处理50个芽,每5 d观察1次,25 d后统计生根、长势情况。

7、炼苗

将生根的瓶苗转移至培养室外进行炼苗,处理时间设置见表5。炼苗后清水洗净根部培养基,移栽至加水拌成泥状的菜园土基质。栽培条件:自然光,气温25~30 ℃。移栽15 d后统计成活率。

组培

叶下珠的主要药理活性成分柯里拉京是一种多酚类物质,极容易氧化。在外植体诱导丛生芽的过程中,茎节的切口会分泌大量次生代谢产物,导致外植体褐化,降低组培成功率。外植体褐化程度高,需通过多次转接以避免褐化,但是多次转接易造成污染。本试验通过添加活性炭以吸收次生代谢物,抑制褐化效果良好,也减少人为操作带来的污染。

在芽增殖试验中,1.0 mg·L-1 6-BA 和0.2 mg·L-1 IBA的生长调节剂组合是较适合芽增殖的生长调节剂配比,但他们认为芽增殖中6-BA最佳浓度为2.0 mg·L-1。本研究中6-BA浓度为1.0、1.5、2.0 mg·L-1的芽增殖系数均达3倍以上,并以1.0 mg·L-1时增殖倍数最大,小芽长势最好。

在炼苗移栽研究中,基质为泥状菜园土。泥状土在栽培初期水分饱满,但后期易结块,对组培苗成活率造成一定影响。可适当添加一定比例的有机土进行改良,调整土壤疏松度,以利于移栽苗成活。

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