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组织培养的接种

文章作者:zhuobo 发布时间:2020-11-25 16:48:08 浏览次数:0

  接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%~3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外,还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾,使空气中灰尘颗粒沉降下来。

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  无菌操作的步骤

  1.在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室,并打开其内紫外线灯进行杀菌;

  2.在接种前20分钟,打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯;

  3.接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等;

  4.上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,特别是指甲处。然后搽拭工作台面;

  5.先用酒精棉球搽拭接种工具,再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;

  6.接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;

  7.接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外线灯灭菌30分钟,若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。

  接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官,经切割或剪裁成小段或小块,放入培养基的过程。

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  无菌接种步骤

  1.将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。

  2.材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1~2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。

  3.用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程(以试管为例)是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管口靠近酒精灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口,可先在管口外面灼烧,去掉棉塞,再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上,以放1~3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外,其他尚无统一要求。接种完后,将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞,塞好后,包上包口纸,包口纸里面也要过火。

  褐化

  解决方案:在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化,对形态发生和器官形成有良好作用。一般认为,活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子,可以减少一些有害物质的影响,但是具体吸附的选择性很差,温度低时吸附力增强,温度高时吸附力减弱,甚至会解吸附,通常使用浓度为0.5-10g/L。加入活性炭后使培养基变黑,对一些植物诱导生根有利。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加些琼脂。很细的活性炭容易沉淀,因此通常在琼脂将要凝固时,需轻轻摇动培养瓶。

  酚污染

  解决方案:植物外植体组织在接种时的切割面会溢泌一些酚类物质,在接触空气中的氧气后,其会氧化为相应的醌类物质,产生可见的茶色、褐色或黑色,此即谓“酚污染”。在木本植物,尤其是热带木本植物及少量草本植物中,此现象较为严重。


  常用的防治措施如下

  1、试用抗酚类氧化的药剂(半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面,或加入固体培养基的表层,或将刚切割的外植体浸入其中一定时间)

  2、适当降低培养基温度。

  3、接种后先进行一定时间的暗培养。

  4、及时转接入新鲜培养基。

  5、选择切取外植体部位等。


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