愈伤组织的培养及外植体的选择与培养

愈伤组织的培养

在植物组织培养过程，植物的细胞、组织、器官等均可作为外植体进行离体培养。依据外植体来源的不同，植物组织培养可分为愈伤组织培养、器官培养、花药和花粉培养、胚培养、细胞培养、原生质体培养。

愈伤组织是指在形态上没有分化但能进行活跃分裂的细胞团，细胞分裂疏松无序或较为紧密。在自然状态下，当植物体的一部分受到机械损伤、昆虫咬伤或风雪等自然灾害的袭击后，能够在伤口处形成疑团愈伤组织，起到修复和保护作用。在离体培养条件下，许多植物的外植体也会出现类似情况，在外植体切口处及其附近形成愈伤组织；所不同的是离体培养条件下产生的愈伤组织细胞具有再分化的潜力，即细胞能够分裂、增殖和分化出不同形态、执行不同功能的组织和器官。

愈伤组织培养是植物组织培养中一项很重要的技术，绝大多数植物在培养时都要先经过愈伤组织阶段，再进行形态发生过程。主要应用于研究植物生长发育及分化机制、遗传变异规律；还可用于大规模工厂化生产有用化合物，或作为原生质体培养材料来源等。

愈伤组织的诱导和分化

从培养的植物材料获得愈伤组织，大致可分为诱导、分裂和分化3个阶段。

诱导期

用于诱导愈伤组织的植物材料是由已经分化的成熟植物细胞组成，如叶片是由表皮、叶肉和叶脉3部分组成，其构成的各种类型细胞均为已经分化的成熟细胞，大部分已经丧失了分生能力，不能进行细胞分裂。根据植物细胞全能性理论，已高度成熟和分化的植物细胞，也还保持着恢复到分生状态的能力。

植物愈伤组织培养是利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原有发育方向，失去原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态，这就是脱分化过程。实现此过程可通过在培养基中添加植物生长调节剂，促使已分化的细胞改变原有代谢途径，为重新启动细胞分裂做准备。

诱导阶段的长短取决于该细胞原来的生理状态、培养基中植物生长调节剂的种类、含量和相对比例以及培养条件的因素。如菊芋的诱导期只需1d，胡萝卜的诱导期则需要几天时间。一般培养材料细胞的分化程度愈高或愈成熟，进行脱分化诱导也就愈加困难，需要的时间也就越长。在诱导期，通过一些刺激因素和植物生长调节剂的诱导作用，使其合成代谢活化，细胞内的合成代谢迅速进行，但是细胞的大小并没有多大改变。

外源植物生长调节剂对诱导细胞分裂效果最好，其在植物愈伤组织培养中得到广泛的应用。因此，依据实际情况，可通过调整生长调节剂的种类和浓度来诱导细胞进行分裂。经过诱导的植物细胞在内部生理上将发生显著的变化，如细胞质增加、出现活跃的原生质环流、储藏物质淀粉等消失，蛋白质和核酸的含量增加，为启动细胞分裂做准备。

分裂期

分裂期是指细胞通过分裂方式，不断增生子细胞的过程。对一些植物来说，诱导细胞分裂和使细胞保持分裂能力可能需要相同的条件，即在同一条件下就可完成细胞脱分化全过程。但也有一些植物在完成短时间诱导后，需要改变培养基成分和培养条件，否则只能见到少量愈伤组织或或完全没有肉眼可见的变化。一般来说，诱导阶段需要较高浓度的生长素和细胞分裂素，细胞分裂阶段则要适当降低植物生长调节剂的浓度。植物细胞一经诱导，其外层细胞完成脱分化过程，细胞开始迅速分裂。在细胞体积变小，内无液泡，细胞核和核仁增至最大，RNA含量持续上升等。培养物的形态变化表现为外层细胞分裂迅速。

分裂期愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。如果在原培养基上继续培养，细胞将不可避免地发生分化，产生新的结构，但把组织块及时转移到新鲜的培养基上，则愈伤组织可无限制地维持在不分化的增殖状态。

外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差异，如烟草、胡萝卜等脱分化较容易，而禾谷类植物的脱分化较困难；花器脱分化较易，而茎、叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。

分化期

分化期是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能各异细胞的时期，其主要形态变化如下：

细胞分裂部位和方向发生变化。分裂期细胞主要进行平周分裂（局限于组织外缘并于组织周缘平行的分裂），而在分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢，并停止。转变为愈伤组织内部深处的局部区域的细胞分裂，使分裂面的方向改变，出现了由分生组织构成的“瘤状结构”。

形成分生组织瘤状结构和维管组织。迅速生长的愈伤组织是类似的，处于分化期的愈伤组织会形成由分生组织组成的瘤状结构，它们往往变成不再进一步分化的生长中心，而从其周缘产生扩展的薄壁细胞，其结果使一个活跃生长的愈伤组织形成一种“泡状”增殖的特征。在愈伤组织中，可形成维管组织，但通常并不形成维管系统，而是呈分散的节状和短束状结构，它可由木质部组成，或由木质部、韧皮部形成层组成。在所有生长调节剂中细胞分裂素对木质部诱导作用比较明显。

细胞的形态大小保持相对稳定，体积不再减小，愈伤组织不再增殖。

出现了各种类型的细胞，如管胞、筛胞、薄壁细胞、石细胞、色素细胞等。

愈伤组织的形态发生

在植物材料培养过程中，植物细胞经过脱分化过程和持续的细胞分裂而形成愈伤组织。在愈伤组织中形成一些分生细胞团，随后再分化出各种器官原基，甚至体细胞胚，进而发育成苗或完整植株。

器官形成：愈伤组织培养中器官发生分为3个不同阶段：

①细胞增殖或离体外植体脱分化形成愈伤组织。

② 愈伤组织中形成一些分生细胞和瘤状结构。

③ 在一定条件下，分生细胞逐渐转变成为纵轴上表现出单向极性器官原基，即分化出芽和根。

在植物组织培养中，当外植体形成愈伤组织后，可通过调整植物生长剂比例促使芽和根的分化。一般来说，生长素有利于愈伤组织形成根，细胞分裂素可促进愈伤组织形成芽。愈伤组织的器官发生顺序有4种情况：

① 愈伤组织仅仅有芽或根器官的分别形成。

② 芽形成后，在其茎基部长出根而形成小植株。

③ 先形成根，再从根的基部分化出芽形成小植株。

④ 在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。

体细胞胚的发生

植物的体细胞在一定条件下诱导形成的类似合子胚的结构称为体细胞，也称胚状体。在离体条件下，培养细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，最终形成具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。

细胞经由胚状体方式形成完整植株，与不定芽和根的发生相比，有以下3个特征：

① 具有两极性。

② 胚状体与外植体维管组织之间无直接联系。

③ 胚状体维管组织分布呈“Y”形。

外植体的选择与消毒

外植体的选择

外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。

1、选择优良的种质及母株

无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。

2、选择适当的时期

组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。

3、选取适宜的大小

培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。

4、外植体来源要丰富

为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。

5、外植体要易于消毒

在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。一般地上组织比地下组织消毒容易，一年生组织比多年生组织消毒容易，幼嫩组织比老龄和受伤组织消毒容易。

外植体取材的部位

植物组织培养的材料几乎包括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。

1、茎尖

茎尖不仅生长速度快，繁殖率高，不容易发生变异，而且茎尖培养是获得脱毒苗木的有效途径。因此茎尖是植物组织培养中最常用的外植体。

2、节间部

大部分果树和花卉等植物，新梢的节间部是组织培养的较好材料。新梢节间部位不仅消毒容易，而且脱分化和再分化能力较强，因此是常用组织培养材料。

3、叶和叶柄

叶片和叶柄取材容易，新出的叶片杂菌较少，实验操作方便，是植物组织培养中常用的材料。尤其是近年在植物的遗传转化中，以叶片为试验材料的报道很多。

4、鳞片

水仙、百合、葱、蒜、风信子等鳞茎类植物常以鳞片为材料。

5、其他

种子、根、块茎、块根、花粉等也可以作为植物组织培养的材料。

不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是不一致的。如百合科植物风信子、虎眼万年青等比较容易形成再生小植株，而郁金香就比较困难。百合鳞茎的鳞片外层比内层的再生能力强，下段比中、上段再生能力强。选取材料时要对所培养植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选出合适的、最易表达全能性的部位作为为植体。

外植体的消毒

植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。

常用的消毒剂

理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。

常用消毒剂的使用方法及效果

①酒精

酒精是最常用的表面消毒剂，以70%~75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。

酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。

②升汞

 又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。

③次氯酸钠

次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。

④漂白粉

漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)2]，消毒效果很好，对环境无害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。

⑤过氧化氢

 也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。

⑥新洁尔灭

是一种广普表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。

消毒方法

茎尖、茎段及叶片等的消毒

消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。

消毒时在超净台上操作，先用70%酒精浸泡10~30s，以无菌水冲洗2~3次，然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%次氯酸钠浸泡10~15min或用0.1%升汞浸5~10min。消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分地接触。若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴Tween-20，最后用无菌水冲洗3~5次。

果实及种子的消毒

先用自来水冲洗10~20min，再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸10min，后用无菌水冲洗2~3次。种子则先用10%次氯酸钠浸泡20~30min，难以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10min。对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡8~10min。

花药的消毒

用于组织培养的花药多未成熟，其外面有花萼、花瓣或颖片保护，处于无菌状态。消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2~3次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗2~3次。

根及底下部器官的消毒

由于这类材料生长于土壤中，表面带菌量大，消毒较为困难。可先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸5~10min或2%次氯酸钠中浸10~15min，最后用无菌水冲洗3次。

在操作时要根据材料的大小、幼嫩、质地等差异做出判断后，再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间，切不可生搬硬套。消毒的最佳效果应以最大限度地杀死材料上的微生物，而又对材料的损伤最小为好。

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