黑提葡萄组培快繁技术

1 葡萄组织培养的研究与应用

  1.1 葡萄组培研究简史

  世界上关于葡萄组织培养快速繁殖体系建立工作已取得了跨越式的进展，利用葡萄的叶片、叶柄、单芽茎段等外植体，通过器官发生途径获得了再生植株 ;利用葡萄的叶片、茎段等外植体及原生质体，通过体胚发生方式获得了完整植株，快速形成无性繁殖体系。

  1.2 应用前景及意义

  快速扩繁经济价值较高或者稀有的植物品种，受到区域、季节变化的局限，很难达到快繁的目的;尤其是在短时间内需要达到一定数量，创造经济价值高的植物，则需要通过组织离体培养的方法才可以实现。组培作为新兴技术,已经广泛应用于葡萄育种、葡萄种质资源保存、葡萄生产等方面。近年来，新疆黑提葡萄发展非常迅速，对壮大新疆林果经济和提升百姓生活质量水平起到了巨大的推动作用。对葡萄品种的选育和引进，可在短时间内提供大量优良种苗木，达到生产的需求。

  2 外植体的剪取、消毒

  2.1 外植体的剪取

  外植体剪取以春季和秋季为宜，选择地上部分生命力旺盛的枝条茎段作为外植体，避免选择在阴雨天剪取，晴天待露水晒干后剪取，剪取前喷施杀虫剂和杀菌剂。将采回的黑提葡萄茎段(半木质化，附带腋芽)用自来水冲洗3～5次，剪去病、虫、长势弱枝和大叶片后再剪成2～3 cm Y字小型茎段，放入干燥灭菌的广口瓶中，加入洗洁精清洗后将洗洁精冲洗干净，后用蒸馏水冲洗2～3遍。

  2.2 外植体的消毒

  在超净工作台上倒入无菌水浸泡并冲洗1次，缓慢倒出无菌水加入75%酒精浸泡7～8 s，快速倒出酒精以免损坏外植体，再使用无菌水冲洗2遍后加入0.1%升汞浸泡，放置7 min左右倒出，使用无菌水冲洗3～4次，取出高压蒸汽灭菌的滤纸，将茎段放在滤纸上吸干水分，使用无菌剪剪去褐变枝端。外植体茎段消毒灭菌过程务必在超净工作台(无菌)进行操作。

  3 培养基的配方及制备

  3.1 培养基的成分

  离体组织培养期间，培养基能提供外植体生长主要的营养物质和生长因子。

  3.1.1 无机营养物

  13种植物生长的必需的元素，即磷(P)、氮(N)、钙(Ca)、钾(K)、镁(Mg)、锌(Zn)、钼(MO)、氯(Cl)、硫(S)、铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)和铜(Cu)，在培养基中加入的盐类中全部含有。

  3.1.2 有机营养物

  有机营养物主要有2类，其中：有机营养物质可为植物细胞提供碳、氢、氧、氮等必需元素，如糖类、氨基酸及酰胺类;生理活性物质在植物的代谢过程中可起到一定的作用，如烟酸和肌醇等。

  3.1.3 植物生长激素

  植物生长激素包括人工合成生长激素物质以及植物天然的5类激素物质，其中，常用生长素有萘乙酸和吲哚乙酸，常用的细胞分裂素有6-苄基氨基嘌呤，常用的赤霉素类物质，常用的乙烯类物质有乙烯利和乙烯。

  3.1.4 其他附加物

  其他附加物成分对植物细胞生长有促进作用，但不是植物细胞生长所必需。

  固体培养基的必需成分为琼脂，为降低组织培养物的有害代谢物浓度，可以加入适量的活性炭，以利于植物细胞生长;在快繁进程中由菌类污染造成成百上千组培苗损失的现象较为普遍，适当加入抗生素不仅能挽回大量培养物，而且也能节约大量的物力、时间及人力。

  3.2 培养基的选定

  不同植物体的不同生长阶段所需的培养基种类不同，需针对不同阶段进行选择。组培培养使用较广泛的培养基主要有MS培养基、NN培养基及BR培养基等。其中，MS培养基主要作用于愈伤组织诱导组织分化等阶段，葡萄组培常用MS培养基。

  3.3 培养基的制备

  3.3.1 MS培养基母液的制备

  3.3.1.1 母液A(大量元素)

  使用电子天平称取KNO3(19g)、NH4NO3(16.5g)、MgSO·4H2O(3.7 g)、KH2PO4(1.7 g)、CaCl·22H2O(4.4 g)放入不同烧杯。烧杯中加入少量蒸馏水搅拌均匀使药品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸馏水定容至1 000 mL，充分摇匀。

  3.3.1.2 母液B(微量元素)

  使用电子天平称取NaMoO4·2H2O(0.012 5 g)、H3BO3(0.31 g)、CuSO4·5H2O(0.001 25 g)、MnSO4·4H2O(1.115 g)、CoCL2·6H2O(0.001 25 g)、KI(0.041 5 g)、ZnSO4·7H2O(0.43 g)放入不同烧杯。 烧杯中加入少量蒸馏水搅拌均匀使药品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸馏水定容至1 000 mL，充分摇匀。

  3.3.1.3 母液C(铁盐)

  使 用 电 子 天 平 称 量FeSO4·7H2O(1.39 g)、Na2EDTA(1.85 g)，放入不同烧杯。烧杯中加入少量蒸馏水搅拌均匀使药品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸馏水定容至500 mL，充分摇匀。

  3.3.1.4 母液D(有机附加物质)

  使用电子天平称量烟酸(0.025 g)、肌醇(5.0 g)、VB1(0.005 g)、VB6(0.025 g)、甘氨酸(0.1 g)，放入不同烧杯。烧杯中加入少量蒸馏水用玻璃棒搅匀使药品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸馏水定容至500 mL，充分摇匀。

  3.3.2 激素的配制

  6BA(0.5mg/mL)、IBA(0.5mg/mL)、NAA(0.5mg/mL)，使用0.1mol/LNaOH或少量95%的酒精溶解。

  3.3.3 MS培养基的熬制

  在1 L水中加琼脂6 g，糖30 g(水烧至沸腾后先加琼脂再放糖)，全部溶解后搅拌均匀再次定容至1 L，调节pH至5.8～6.4。

  3.3.4 培养基的分装

  按照使用的目的和要求将培养基倒入规定的容器中，容器应当有一定的密闭性和透气性，并且方便高压蒸汽灭菌，适合植物生长。

  3.3.5 培养基的灭菌

  瓶装培养基在121℃的温度下进行高压蒸汽灭菌15 min。

  3.3.6 培养基的存放

  制备好的瓶装培养基应置于阴暗、低温处存放，并标注培养基类型编号以免混淆，宜尽早使用。

4 愈伤组织和瓶苗的培养

  外植体培养2周左右会出现愈伤组织，应关闭灯光或遮光处理，在黑暗条件下愈伤组织生长速度更快，培养基养分耗尽必须更换培养基进行继代培养;继代培养过程中应选择不同的生长激素来调剂不同部位的生长情况：黑提葡萄茎尖愈伤诱导适培养基为IBA 0.10 mg/L+1/2MS+6BA 1.0 mg/L，茎叶分化以IBA 0.10 mg/L+l/2MS+6BA 1.5 mg/L为宜，生根培养以IBA 1.0 mg/L+1/2MS为宜，黑提葡萄组织快繁中使用激素浓度不可过高。

  5 瓶苗的移栽和锻炼

  当黑提葡萄瓶苗生长至大量粗壮根系、有5～8片叶、高4～8 cm时，则将黑提葡萄瓶苗转移至室内自然光下锻炼3 d，使其适应温室室内环境，再将组培苗瓶盖打开一半，在温室内练苗2 d，然后将瓶盖全部打开1 d。从培养瓶中取出小苗，用清水洗掉根部附着的培养基，以免带入蛭石导致根腐，移栽前将瓶苗根部快速蘸取低浓度生根剂和多菌灵后移栽于营养钵中，浇水浸透后覆盖薄膜或搭建拱棚保湿，每2～3 h用喷壶喷1次叶面水(可加少量生根剂);培养环境为20～25℃的温室条件下，基质温度高于气温温度佳。经过15 d后，黑提葡萄叶片转绿增大，出现3～5片新绿嫩叶，新发出白色侧根时移入苗床栽植，30 d后叶片逐渐增大，慢慢木质化，成活率达95%以上，便可转入常规栽培管理。