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组织培养常遇到的问题-组培

文章作者:腾昊科技 发布时间:2022-01-22 20:56:08 浏览次数:2111


1. 培养基配制注意事项

植物组织培养最常用MS培养基,包含十几种化合物。有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀,影响培养基的营养成分,所以MS培养基需要配制多种高倍母液。

 

配制母液时,尤其涉及大量元素的母液时,一定要等一种成分溶解之后,再缓慢的添加另一种成分;切记一锅煮,即不能将各种化合物一齐添加进去。

 

2. 灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软

植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感,pH 值低于5很难成胶或凝胶偏软,切记高压灭菌前调节培养基 pH 值(5.5 - 6.0)。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求,也就是相对于 MS 培养基,1 / 2 MS 培养基中植物凝胶要适当增加用量。


 

另外灭菌后,倒出培养基前一定将培养基摇匀(带防烫手套),因为琼脂密度大底层含量高,容易造成培养基强度不均匀。

 

3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分,在使用过程中有无区别?

水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用,通常用量在 500 mg/L,不管是酸解还是酶解,作用都是一样的,酶解更有利于发挥其作用。

 

4. 怎么溶解组培常用植物激素?

IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量 95% 的乙醇中,再加水定容配制成母液。

 

如有结晶析出,可考虑用 1 / 10 体积的乙醇溶解后再定容;2,4 -D 易溶于碱性水溶液,可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容;KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解,再加水定容到一定的浓度。

 

5. 细胞分裂素使用浓度?

一般情况下在培养基中加入 0.1~10.0 mg/L 的细胞分裂素(6 -BA/KT/ZT),多数用 1.0~2.0 mg/L,KT 浓度为 0.5~2 mg/L,浓度要根据实验材料来调整。细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。


 


6. 哪些植物激素能高压灭菌,哪些不能高压灭菌?

IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高温高压灭菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌,否则会分解失效,该类植物激素配制母液后需用 0.22 微孔滤膜过滤除菌,待培养基冷却(50 - 60℃)后尚未凝胶前加入混匀。

 

7. 培养基的 pH 值会凝胶硬度有无影响?

有影响。

 

若将培养基 pH 值调的过高(大于 6),则培养基偏硬,增加接种的阻力,会对外植体造成损伤。

 

若将培养基 pH 值调的过低(小于 4.5),则培养基不能凝固,起不到固定外植体的作用。一般将培养基的 pH 调节至 5.5~6.0 为宜。

 

8. 灭菌过程是否影响培养基的 pH 值?

培养基中的蔗糖和激素在高温灭菌过程中容易酸化,培养基 pH 值灭菌后会有所下降,灭菌前培养基的 pH 值偏低可能导致培养基不凝或偏软。要求偏酸性的培养基可适当增加琼脂或植物凝胶的用量。

 

9. 应用 75% 的酒精进行种子消毒的过程中需要注意哪些问题?

种子在消毒过程中使用 75% 的酒精应慎重,酒精渗透力极强,消毒时间过长会直接影响种子发芽率,所以建议消毒时间不应超过 1 min。

 

10. 原始繁殖材料的消毒

组培原始繁殖的外植体消毒,直接影响整个培养过程。

 

从室外采回来的外植体需进行消毒,首先用自来水冲洗外植体,冲洗时间可根据采集部位不同而定,一般在 5~15 分钟即可;在超净台中进行药剂的处理,常用的药剂处理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯酸钠溶液和 0.1~0.2% 的升汞溶液,具体可根据实验材料而定。应注意的是经升汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗 6~8 次。


 


11. 怎样处理植物组织培养过程中出现的各种污染?

植物组织培养过程中的污染来源主要分为 3 种:真菌、细菌、组织培养过程中的污染源

在操作过程中,难免有菌落入培养基或植物材料上导致污染。不正确操作也会增加污染几率。

预防措施:通风、保持室内空气干燥、紫外杀菌等。污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。

 

污染原因判断:

1)培养基污染 

若污染菌类是零星分散在培养基中,可确定是人为引起的污染。比如:培养基灭菌不彻底,开瓶时间过长,灭菌后存放时间过长,高温蒸汽灭菌器的温度、压力、时间没有正确设,过滤灭菌过程中滤膜孔径选择,过滤灭菌器的灭菌处理,过滤灭菌操作等。这些均会影响培养基的灭菌效果。

措施:严格按照实验要求,灭菌规程操作。

 

2)外植体污染 

若污染菌类是从材料周围长起,且发生在 5 天以后,则说明是材料带的内生菌。可能是接种用具灭菌不彻底,接种时材料被污染;

若从培养基以下开始长菌,发生时间较早,且有从里向外的趋势,则说明是切口引起的污染,原因可能是未剪去两个切口或者虽剪去切口但是所用器具带菌;或者是未及时发现污染苗,接种过程中引起交叉污染;

措施:取材时应仔细选择,以减少污染的发生。

 

3)操作环节污染 

接种室是否清洁、干燥、密封,是否经常用紫外灯照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精喷雾杀菌等;超净工作台摆放物品杂乱,长时间不换滤网,导致净化能力降低;接种用具灭菌不彻底引起污染;操作不正确等。

措施:每次接种前半个小时,用 20% 的新洁尔擦洗室内设备、工作台面,再用紫外灯照射 20 min,喷洒 70% 的乙醇进行消毒。除了培养基、接种材料、器具和用具保证无菌外,同时在接种时还需要严格进行无菌操作。

措施:

1)真菌污染后,如果已形成孢子,则必须经高压灭菌后扔掉;若是细菌污染,只要及时发现,将材料上部未感染菌的部分剪下转接,材料仍可以用。

2)用抗生素等杀菌药剂处理。至今还未发现哪种抗生素能够对各种菌都有效,并且常影响植物材料的正常生长分化。另一些药剂,虽有的杀菌效果好,但往往容易引起盐害,也无法利用。

 

12. 外植体的选择

为了使接种后的诱导得以成功,选择的外植体应该是幼嫩、处于生长旺盛时期的,选择的外植体的体积不能过小,如若过小则会影响愈伤组织的形成,从而影响进一步的分化。因此,一般接种的外植体体积在 0.5~1.0 cm2 的范围内即可。最适的为茎尖、带芽、茎段,也可以利用叶子、子叶、根段、花器官组织等。

 

13. 植物茎段组织培养需要注意哪些问题

以茎段进行组织培养比较容易,一般取植物的嫩茎切段作为外植体,切成 0.5~1 cm 长的小段进行接种,保证每个茎段有一个芽点和一片叶子,将芽点部位以下垂直插入培养基凝胶中进行生根培养。

 


14. 外植体接种需要注意的操作事项

接种前首先进行灭菌消毒,接种所用的镊子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高温高压灭菌,提前 10 分钟打开超净工作台,灭紫外 15~20 min,操作人员要用 75% 的酒精棉球擦手、工作台和器皿,解剖刀和镊子等随时擦酒精灼烧,晾凉后备用。

在无菌培养皿或滤纸上切割外植体,接种到培养基表面,注意瓶口倾斜接近酒精灯火焰。

 

15. 组织培养中材料褐化现象

不同品种以及生理状态引起的褐化状态不同。培养基过高浓度的无机盐及高水平细胞分裂素会使褐化现象加重。培养条件不当,例如光照过强、温度过高、培养时间过长等,均可使多酚氧化酶的活性提高,从而加重外植体的褐变程度。

 

防治措施:

选择合适的外植体:选择生长处于旺盛的外植体,可以使褐变现象明显减轻。

合适的培养条件:无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

使用抗氧化剂:在培养基中,使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP 等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用 0.1%~0.5% 的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

连续转移:对容易褐变的材料可间隔 12~24 小时的培养后,再转移到新的培养基上,这样经过连续处理 7~10 天后,褐变现象便会得到控制或大为减轻。

 

16. 材料玻璃化问题

植物材料不断地进行离体繁殖时,有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明、水迹状,这种现象通常称为玻璃化。

 

玻璃化为试管苗的生理失调症,试管苗生长缓慢、玻璃化的嫩茎不宜诱导生根,繁殖系数有所下降。当培养基上细胞分裂素水平较高时,容易出现玻璃化现象。

 

愈伤组织的玻璃化问题主要表现在培养过程中愈伤组织松散、脆易碎。叶子或是长出的愈伤一段时间后在其周围出现水渍化,继而影响整个培养基。

 

防治措施

在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质,降低培养基中细胞分裂素含量及含氮化合物的用量,选用低 NH4 +水平的 B5 培养基,都能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生;

增加光照,对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用;在培养基中添加活性炭、马铃薯汁、间苯三酚等可有效的减轻和防止玻璃化。

 

17. 材料水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯

可能原因:表面杀菌剂过量,消毒时间过长,外植体选用不当(部位或时期)。

改进措施:调换其他杀菌剂或降低浓度,缩短消毒时间,试用其他部位,生长初期取材。

 

18. 材料长期培养几乎无反应

可能原因:培养基不适合,生长素的选择和用量不当,植物激素对生长发育和生理过程的调节作用,往往不是某一种植物激素的单独效果;环境温度不适宜。

 

改进措施:

更换培养基或调整培养基成分,尤其是调整盐离子浓度;

调整激素的种类与配比,增加生长素用量,例如使用人工合成的生长素类似物 2,4 -D 等可有效促进细胞分裂和伸长,新器官的分化和形成;

调整培养温度等环境条件。

 

19. 愈伤组织生长过旺疏松

可能原因:由于培养基中激素添加过量,培养室温度偏高,矿物质等无机盐含量不当等因素引起的。

 

改进措施:根据不同的品种、不同组织、不同器官,应适当减少激素用量,适当降低培养温度,调整无机盐(尤其是铵盐)含量,适当提高琼脂用量增加培养基硬度,避免愈伤组织生长过旺和疏松现象发生。

 

20. 愈伤组织生长缓慢太紧密

可能原因:细胞分裂素和生长素的用量过多,糖浓度过高。

改进措施:减少细胞分裂素用量,调整细胞分裂素与生长素比例,降低糖浓度。

 

21. 愈伤组织分化率低,畸形,分化出的芽多为叶状芽或丛芽,芽生长困难,不易成苗。培养时间长时,再次愈伤组织化

可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。

改进措施:减少生长素用量,可以通过分化培养时在培养基中添加 GA3(浓度在 0.5~2 mg/L 之间)解决,并适当降低愈伤组织的培养温度。

 

22. 丛生苗过于细弱,不适于生根或移栽

可能原因:细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当,产生过多的不定芽;温度过高,光照短,光强不足;不及时的转移和分切,生长空间小。

 

改进措施:

减少细胞分裂素用量,免用赤霉素;

延长光照时间,增强光照;

及时转接;

降低接种密度;

更换透气的封口膜等。

 

23. 组织培养过程中出现黄化

可能原因:培养基中 Fe 的含量不足,各种矿质营养不均衡;培养环境通气不良,瓶内有害气体积累(乙烯、氨气、甲醛)等会引起植物材料黄化脱落;激素配比不当;糖用量不足或长时间不转移;pH 值变化过大;培养温度不适;光照不足等。

 

改进措施:

改善组培条件,在配制培养基过程中检查仪器设备是否准确;

降低组培苗的接种密度,及时转接培养物;

使用透气的封口膜改善瓶内通气状况;

适当调节 pH 值、激素配比和无机盐浓度;

控制培养室内温度,适当增加光照。

 

24. 植物组培培养基都有哪些?

MS 培养基:1962 年穆拉辛格和斯库格为烟草细胞培养而设计,其中硝酸盐的浓度高,适合植物原生质体、细胞和组织培养。

 

B5 培养基:1968 年甘伯尔格为大豆细胞培养而设计,铵的浓度低。适合木本植物的组织和细胞培养。

 

富盐平衡培养基:是目前使用最广泛的一类,特点是:无机盐浓度高,微量元素种类齐全,浓度高;元素间比例适当,离子平衡性好,具有较强的缓冲能力、稳定性好、营养丰富,一般培养时无需再加入有机成分。

 

高硝态氮培养基:代表性培养基有 B5、N6、SH。特点是:硝酸钾浓度高,氨态氮浓度低,含有较高浓度的硫胺素(VB1)。

 

中盐培养基:大多是在 MS 培养基基础上进行改良设计。特点是:大量元素无机盐为 MS 的一半,微量元素种类减少、含量增高。维生素种类比 MS 增多,例如增加了生物素、叶酸等。

 

低盐培养基:无机盐、有机成分含量浓度低,多用作生根培养的培养基。

 


25. 木本植物(油料植物)组织培养中遇到再生苗无法生根时怎么办?

一般常用的 1 / 2MS 或者 1 / 2WPM 基本能够满足。如果增殖用的都生产正常,到生根的时候出现落叶,只能通过排除法一样样分析。

 

首先看是不是培养温度太高,使用瓶盖后透气性差,导致乙烯积累。其次,可以适当添加少量分裂素,或者更换生长素,以及多种生长素混合使用。

 

26. 培养基中添加糖类作为碳源物质,有何重要作用?

碳源为植物细胞提供能量来源,蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖。采用蔗糖作为培养基的碳源,可一定程度上减少微生物的污染。

 

生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。

 

27. 用于植物原生质体制备的材料,以及常用的渗透压调节剂

用于植物原生质体的材料需要选取生长旺盛的细胞,幼嫩的组织。无菌试管苗的叶片、胚轴及子叶、花药,以及愈伤组织(悬浮细胞)等。

 

常用的调节原生质体渗透压的稳定剂主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。渗透压浓度一般为 0.3~0.8 mol/L。

 

28. 组培苗移栽需要注意的问题

在移栽前打开三角瓶的封口膜,炼苗 3~5d 后取出小苗,用流水洗净根部的培养基,然后移栽到盛有灭过菌的蛭石营养钵中过度一下,但要注意不可直接向营养钵中浇营养液(容易长菌),用透明的塑料薄膜罩住小苗 3~5d 后移栽到土里。

 

29. 光照强度多少 lux 是如何计算的

光照强度 = 光通量/单位面积。Lux 的换算比较抽象,一般以烛光为计算单位,现在所用的以电源发光的光源,记作国际烛光,即 25 瓦特的电灯其光强度等于 25 国际烛光。1 标准烛光 = 10.76 Lux。

 

30. LED 光源在植物组织培养中的选择

光是植物生长中最重要的环境因子之一,并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED 光源 460nm 左右的蓝光和 660nm 左右的红光是植物最需要的光波,对植物的生长发育起着关键性的作用。

 

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